La diagnostica di Laboratorid del Covid-19

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APPROFONDIMENTI

Autore dell'articolo Dott. Emilio Torresani, Direttore del Dipartimento dei Servizi di Medicina di Laboratorio e Componente Direttivo Nazionale dell'Associazione Microbiologi Clinici Italiani.

In collaborazione con il Prof. Marco Tinelli, infettivologo, Componente del Direttivo Nazionale della Società Italiana di Malattie Infettive e Senior Consultant di Auxologico San Luca nell'emergenza Coronavirus

CORONAVIRUS DI INTERESSE UMANO

I Coronavirus sono virus RNA isolati negli anni sessanta dalle cavità nasali dei pazienti con raffreddore comune; sono noti per infettare l'uomo ed alcuni animali (inclusi uccelli e mammiferi).

Si ritiene che i Coronavirus causino una percentuale significativa di tutti i raffreddori comuni negli adulti e nei bambini. I sintomi che si riscontrano più frequentemente sono febbre e adenoidite acuta con maggior incidenza durante l'inverno e l'inizio della primavera. In molti casi i Coronavirus possono causare polmonite, (polmonite virale diretta e polmonite batterica secondaria) e possono portare anche allo sviluppo di bronchite (bronchite virale diretta o bronchite batterica secondaria). 

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Il Coronavirus umano scoperto nel 2003, SARS-CoV, causa una grave sindrome respiratoria acuta (SARS).

La variante SARS dei Coronavirus, apparsa inizialmente in Cina nella provincia del Guangdong nel novembre 2002 e isolata per la prima volta l'anno successivo, ha le stesse identiche caratteristiche morfologiche degli altri Coronavirus, ma sembra sia una specie del tutto nuova derivata probabilmente da un serbatoio animale che ben si è adattato all'uomo. 

Ha una patogenesi unica, perché causa infezioni del tratto respiratorio superiore e inferiore

Tra i fattori che il virus della SARS utilizza per incrementare notevolmente la sua virulenza rispetto agli altri Coronavirus, c'è un potente sistema di inibizione dell'interferone.

Un altro focolaio pericoloso provocato da un diverso ceppo di Coronavirus ha avuto inizio nel giugno 2012 in Arabia Saudita. La malattia è stata perciò indicata col nome di sindrome respiratoria mediorientale da Coronavirus o MERS

Il 31 dicembre 2019 è stato segnalato un nuovo ceppo di questo virus a Wuhan, in Cina, identificato come un nuovo ceppo di β-CoV dal Gruppo 2B con una somiglianza genetica del 76% circa rispetto al SARS-CoV. 

Il nuovo ceppo, di conseguenza, è stato nominato SARS-CoV-2.

A gennaio 2020 sono conosciuti 7 ceppi di coronavirus in grado di infettare gli umani:

  • Coronavirus umano 229E (HCoV-229E);
  • Coronavirus umano OC43 (HCoV-OC43);
  • Coronavirus umano NL63 (HCoV-NL63);
  • Coronavirus umano HKU1 (HCoV-HFU1)[3];
  • Coronavirus da sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV);
  • Coronavirus (MERS-CoV), conosciuto anche come Novel Coronavirus 2012 (2012-nCoV) da Sindrome respiratoria mediorientale;
  • Coronavirus 2 da sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2), conosciuto anche come Coronavirus di Wuhan, responsabile della malattia COVID-19.

LA MORFOLOGIA E LA COMPOSIZIONE DEL COVID-19

Covid-19

I Coronavirus hanno morfologia rotondeggiante e dimensioni di 100-150 nm di diametro.

Il genoma del Coronavirus codifica per 4 proteine strutturali che comprendono la proteina Spike (S), le proteine dell’Envelope (E), la proteina di membrana (M) e il nucleocapside (N).

Dallo strato esterno verso l’interno del virus, è possibile notare le diverse componenti:

  • glicoproteina S: il virus mostra delle spicole (spike) sulla superficie formate dalla glicoproteina S. Tre glicoproteine S unite compongono un trimero e i trimeri formano le strutture che, nel loro insieme, somigliano a una corona che circonda il virione. La glicoproteina S svolge un ruolo fondamentale nell'infezione virale riconoscendo i recettori delle cellule ospiti e mediando la fusione delle membrane virali e cellulari; comprende due subunità funzionali responsabili del legame con il recettore della cellula ospite (subunità S1) e della fusione della membrana che riveste il virus con quella della cellula ospite (subunità S2);
  • proteina M: la proteina di membrana (M) attraversa il rivestimento (envelope) interagendo all’interno del virione con il complesso RNA-proteina;
  • dimero emagglutinina-esterasi (HE): questa proteina del rivestimento, più piccola della glicoproteina S, svolge una funzione importante durante la fase di rilascio del virus all’interno della cellula ospite;
  • proteina E: l’espressione di questa proteina aiuta la glicoproteina S (e quindi il virus) ad attaccarsi alla membrana della cellula bersaglio ed è collocata sul rivestimento del virus, costituito da una membrana che il virus “eredita” dalla cellula ospite dopo averla infettata;
  • RNA: il genoma dei Coronavirus è costituito da un singolo filamento di RNA associato alla proteina N.

Le proteine spike e nucleocapsidica sono le principali componenti immunogene dei CoV e sono prodotte in grandi quantità durante l'infezione.

La proteina spike, è la proteina che consente al virus di attaccare la cellula e fondersi con la membrana della cellula ospite; la proteina N e responsabile dell’aumento di stabilità dell’acido nucleico.

LA TRASMISSIONE DEL COVID-19 E I SINTOMI

COVID-19 (acronimo dell'inglese CoronaVirus Disease 19) o malattia respiratoria acuta da SARS-CoV-2 e più semplicemente malattia da Coronavirus 2019, è la malattia infettiva respiratoria causata dal virus SARS-CoV-2. 

Una persona infetta può presentare sintomi dopo un periodo di incubazione che può variare tra 2 e 14 giorni circa (raramente ci sono stati casi di 29 giorni), durante i quali può comunque essere contagiosa.

Il virus si trasmette per via aerea, molto spesso tramite le goccioline respiratorie. Per limitarne la trasmissione devono essere prese precauzioni, come mantenere la distanza di sicurezza di almeno 1,5 metri, e tenere comportamenti corretti sul piano dell’igiene (lavarsi periodicamente le mani, starnutire o tossire in un fazzoletto o con il gomito flesso e dove necessario indossare mascherine e guanti). 

Il Coronavirus colpisce principalmente il tratto respiratorio inferiore e provoca una serie di sintomi descritti come simil-influenzali, tra cui febbre, tosse, respiro corto, dolore ai muscoli, stanchezza e disturbi gastrointestinali quali la diarrea; nei casi più gravi può verificarsi una polmonite, una sindrome da stress respiratorio acuto, sepsi, shock settico e una tempesta di citochine fino ad arrivare al decesso del paziente. SARS-CoV-2 provoca non solo sintomi respiratori ma sistemici (apparato cardio-vascolare, reni, cute ed encefalo) che aggravano notevolmente la prognosi.

Non esiste ancora un vaccino specifico per questa malattia.

DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DI COVID-19 

IL TAMPONE

Attualmente la diagnostica di laboratorio convenzionale dell’infezione da CoV-19 per una sua identificazione precoce è effettuata con l’impiego di test molecolari (tampon) basati sulla tecnica della reazione a catena della polimerasi inversa (RT-PCR) per la ricerca dell'RNA virale.

La ricerca dell’RNA virale avviene su campioni prelevati dalle mucose del rino-faringe o in altri materiali biologici ottenuti dall’apparato respiratorio (ideale in BAL anche se, però, di difficile gestione).

TAMPONE PER CORONAVIRUS, COME FUNZIONA, QUALI ALTERNATIVE

È possibile effettuare la ricerca e il dosaggio degli specifici anticorpi diretti contro le diverse strutture antigeniche del CoV-19.

La cinetica anticorpale conseguente all’infezione da CoV-19 è particolare e molta letteratura riporta situazioni di comparsa quasi contemporanea degli anticorpi della classe IgM e della classe IgG e la loro presenza nel tempo anche in concomitanza della presenza del RNA virale a livello rino-faringeo. Questo implica che i consueti schemi interpretativi degli esiti immunologici per questa diagnostica non possono essere correttamente utilizzati secondo i canoni classici.

Il tutto avviene anche a distanza di settimane dalla scomparsa della sintomatologia clinica e in non dimostrate condizioni di contagiosità.

Le caratteristiche di sensibilità e specificità dei diversi approcci diagnostici (RT-PCR, ELISA, CLIA, IC) variano sensibilmente in funzione del contesto clinico-epidemiologico nel quale sono utilizzati e, comunque la loro sensibilità appare piuttosto limitata nei confronti degli individui asintomatici.

IL TEST SIEROLOGICO

Il Ministero della salute (nella circolare del 20 maggio 2020) ricorda che “nell’attuale fase dell’emergenza COVID-19, assume particolare rilevanza la tematica dei test diagnostici di tipo sierologico, che possono essere utilizzati per la rilevazione di eventuali anticorpi diretti contro SARS-CoV-2.

TEST SIEROLOGICO PER ANTICORPI SARS COV 2 A MILANO

I test sierologici sono utili nella ricerca e nella valutazione epidemiologica della circolazione virale in quanto: 

  1. costituiscono uno strumento importante per stimare la diffusione dell’infezione in una comunità; 
  2. la sierologia può evidenziare l’avvenuta esposizione al virus; 
  3. i metodi sierologici possono rivelarsu utili per l’identificazione dell’infezione da SARS-CoV-2 in individui asintomatici o con sintomatologia lieve o moderata che si presentino tardi alla osservazione clinica; 
  4. i metodi sierologici possono essere utili per definire il tasso di letalità dell’infezione virale rispetto al numero di pazienti contagiati da SARS-CoV-2. 

Le attuali conoscenze scientifiche relative ai test sierologici per il COVID-19 sono però lacunose relativamente alla capacità di fornire le seguenti informazioni: 

  • presenza di anticorpi neutralizzanti in grado di proteggere dalla infezione o malattia (in genere, un elevato titolo anticorpale correla con la presenza di anticorpi neutralizzanti rilevati al test di neutralizzazione/riduzione delle placche); 
  • persistenza degli anticorpi a lungo termine

In particolare, i test basati sull’identificazione di anticorpi IgM e IgG specifici per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2, secondo il parere espresso dal Comitato tecnico scientifico istituito presso il Dipartimento di Protezione civile, non possono, allo stato attuale dell’evoluzione tecnologica, sostituire il test molecolare basato sull’identificazione di RNA virale dai tamponi nasofaringei. 

TEST RAPIDI E TEST ELISA O CLIA/ECLIA

In merito all’affidabilità dei test sierologici, la qualità e l’affidabilità di un test dipendono in particolare dalle due caratteristiche di specificità e sensibilità, e sebbene non sussistano in relazione ad esse obblighi di legge, è fortemente raccomandato l’utilizzo di test del tipo CLIA e/o ELISA che abbiano una specificità non inferiore al 95% e una sensibilità non inferiore al 90%, al fine di ridurre il numero di risultati falsi positivi e falsi negativi. Al di sotto di tali soglie, l’affidabilità del risultato ottenuto non è adeguata alle finalità per cui i test vengono eseguiti.

Per quanto riguarda, invece, i test rapidi (test eseguiti su sangue capillare), essendo di natura puramente qualitativa, possono solo indicare la presenza o assenza di anticorpi. Si fa presente che, al meglio delle conoscenze oggi disponibili, non vi sono al momento evidenze prodotte da organismi terzi in relazione alla loro qualità.

I test sierologici oggi disponibili utilizzano diverse metodologie e diversi sono anche gli antigeni utilizzati.

I cosiddetti test rapidi, che possono essere effettuati su sangue capillare o venoso (o siero e plasma) utilizzando una metodologia immunocromatografica, esprimono un risultato qualitativo relativo alla presenza di IgG ed IgM. In questa tipologia di test un ruolo fondamentale è giocato dalla loro sensibilità e specificità relativamente alla possibilità di risultati falsi negativi o falsi positivi.

Le linee guida impongono che un risultato positivo debba essere confermato con un test ELISA o CLIA o ECLIA.

I test che utilizzano metodologia ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) o di successiva evoluzione come CLIA e ECLIA (chemiluminescenza ed elettrochemiluminescenza) esprimono valori quantitativi in termini di concentrazione o di indice e possono essere impiegati su matrice serica o plasmatica per la ricerca di Ig Totali, di IgG, IgM ed IgA.

Questa tipologia di test garantisce caratteristiche di specificità e sensibilità alquanto elevate.

L'OMS nella guida ad interim per i test di laboratorio è favorevole allo sviluppo di dosaggi sierologici da utilizzare come ausilio nell'indagine di un'epidemia in corso e come valutazione retrospettiva.

Il significato attuale dell’indagine sierologica assume quindi un aspetto importante per la valutazione epidemiologica relativa alla circolazione del virus (con particolare riguardo alla ricerca di Ig Totali e/o IgG ) e alla possibilità di stabilire il significato della presenza di specifici anticorpi ad azione neutralizzante ai fini di stabilire la protezione dei soggetti che hanno contratto l’infezione in termini di immunità e della sua durata nel tempo.

L’effetto neutralizzante degli anticorpi consiste nel meccanismo con il quale viene impedito al virus di legarsi ai recettori cellulari e/o ne viene impedito il corretto meccanismo replicativo impedendo quindi che all’infezione consegua la malattia.

L’azione di neutralizzazione viene testata in vitro su colture cellulari ed utilizzando virus vivi con il Plaque Reduction Neutralization Test (PRNT). Tale test non è sicuramente impiegabile nella maggior parte dei laboratori.

Ad oggi si è comunque osservato, pur in un numero ancora ristretto di casi, che i test che utilizzano metodologia CLIA o ECLIA basati sull’impiego di antigeni S o N per la ricerca di IgG o di Ig Totali mostrano una buona correlazione con i test di neutralizzazione in vitro con concordanze negative (PNA) superiori al 97% e concordanze positive (PPA) dal 86% al 94% .

LA NEGATIVITÀ E POSITIVITÀ DEL TEST SIEROLOGICO

Tutti i test sierologici vanno utilizzati ed interpretati con cautela tenendo presente che nel caso di negatività della ricerca il soggetto deve essere inquadrato come “recettivo” e comunque oggetto di valutazione clinica al fine di escludere la situazione temporale di infezione contratta recentemente.

Un esito positivo può essere considerato sinonimo di avvenuta infezione.

Infatti allo stato delle conoscenze attuali, anche la presenza di anticorpi non indica che il paziente non sia contagioso o che non possa essere re-infettato dal virus in futuro, né è noto per quanto tempo le IgG rimarranno rilevabili e non può quindi essere espressa garanzia di una immunità. 

Nei soggetti positivi alla ricerca di anticorpi deve pertanto essere effettuata una valutazione clinica e la ricerca del’RNA virale con metodiche di biologia molecolare su tampone rino-faringeo.

Peraltro la possibilità di disporre di test a risposta rapida per la ricerca di RNA rappresenta interessante ed utile metodologia per attuare misure di prevenzione e contenimento della diffusione dell’infezione nell’immediato futuro.

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